超级感受态细胞与超高多样性噬菌体展示库的构建

一、分子生物学中的Transformation（转化）

做分子生物学的研究人员几乎每周都会使用转化技术。它是分子生物学的一项常规技术，通过将外源DNA（如质粒、线性片段或合成基因）引入宿主细胞，使细胞获得新的遗传特性。这个过程通常需要宿主细胞处于特定的“感受态”（Competent State），这样细胞的膜有足够透性，能够接收外源DNA。一旦DNA进入宿主细胞，它可以整合到细胞的基因组中或以质粒的形式独立存在。

转化技术的应用场景

(1) 基因克隆：科学家可以通过转化将特定基因引入细菌，如大肠杆菌，然后利用这些细菌作为“工厂”来制造蛋白质或进一步研究该基因的功能。

(2) 遗传工程：转化技术可以用于创建改造过的生物体，例如，通过将DNA片段引入植物细胞，可以培育出抗病虫害或具有改善的营养特性的转基因作物。

(3) 基因治疗：在一些先进的治疗策略中，转化技术被用于将治疗性基因转移到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病或某些类型的癌症。

二、感受态细菌和转化方法

转化技术允许我们将外源DNA导入不同类型的宿主细胞，如细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。不同宿主细胞类型需采用适合的转化方法，包括电穿孔、化学转化、基因枪和病毒介导转化等技术。今天，我们将集中讨论感受态细菌和它的转化方法。

感受态细菌能接收并集成外源DNA到它们的基因组当中，这种能力被称为感受态能力。高感受态能力对于高效率和低成本的细菌转化至关重要，它也是分子克隆、遗传工程和其他基因操作技术的基础。然而细菌并不是天生就具备这种高度的感受性，我们需要特定的方法来加强它们接收外源DNA的能力。

第一步，我们需要将普通细菌处理成感受态细菌，涉及的要点是让细菌的细胞壁和细胞膜变得更容易被DNA穿透。第二步，应用物理或化学手段进进一步强化细菌的感受态能力，并完成转化过程。

细菌转化过程主要分为化学转化和电穿孔两种类型，因此市场上销售的感受态细菌也主要有两种：化转用感受态细菌和电转用感受态细菌。它们有不同的应用场景，不可互换，因此新手在实验时要注意以避免混淆和错误。

化学转化法，尤其是氯化钙方法，因其简便性和低成本而在分子克隆实验中广受欢迎。氯化钙方法，由Mandel和Higa提出[1]，利用Ca2+破坏细胞膜的脂质结构，帮助外源DNA穿透细胞内。其转化率（Transformation Efficiency）一般在106 cfu/μg DNA，这里的cfu是克隆形成单位（Colony Forming Units），所以转化率是指1μg DNA能够真在转化到多少个细菌中。对于仅需获取一个阳性克隆的基础克隆实验来说，化学转化的效率已经足够。

电穿孔法[2]，通过施加一个短暂的高电压脉冲来破坏细菌细胞膜的结构，形成微孔，让DNA进入细胞。在大肠杆菌中，电穿孔法的转化效率可以达到109 cfu/μg DNA，远超化学转化，因此电穿孔法非常适合多样性高的DNA文库的细菌转化。但是，电穿孔法需要使用专门的电转仪。

三、电转用超级感受态细菌和噬菌体展示库的构建

对于多样性小于109 的DNA文库的转化，比如蛋白突变DNA文库、免疫动物的抗体DNA库等，普通的电转感受态细菌就可以满足要求。但是对于多样性大于109 的DNA文库的转化，比如动物或者人的Naive抗体DNA库、合成抗体库等，这还需要使用电转用超级感受态细菌。

超级感受态细菌（Supercompetent Cells）是经过特殊处理获得极高感受态能力的细菌，能够以极高的效率接收外源DNA。在适当的电转参数下，超级感受态细菌的转化率可以高达1011 cfu/μg DNA。使用这些细菌，可以在短短一周内，通过单次电转和一次培养扩增，有效构建具有十亿级多样性的噬菌体展示库，如抗体库、多肽库或T细胞受体（TCR）库。这不仅极大提升了工作效率，还显著降低了成本。

为什么超级感受态细菌会有极高的感受态能力呢？有几个关键因素值得注意，它们可以被视为进一步增强细菌感受态能力的方向：

超级感受态细菌获得极高感受态能力的方法

(1) 选择对数生长期的细菌（通常OD600=0.6-0.8）用于制备超级感受态细菌，这一点与制备普通感受态细菌的材料选择是一致的。

(2) 在超级感受态细菌的培养基中添加适量的甘油，通常浓度在0.2%到0.5%之间。甘油的加入能够促使细菌吸收并改变其细胞膜磷脂和蛋白的组成，从而提高细胞膜的通透性，增加对DNA的摄取能力。这种处理是超级感受态细菌制备过程的一个特殊步骤，非常关键。

(3) 在超级感受态细菌的保存液中同样加入适量的甘油，一般为10%到15%，这一点与普通感受态细菌的处理相似。加入甘油可以在细菌冷冻过程中减少冰晶的形成，避免由此对细胞膜的破坏；同时在电转过程中，电场会导致细胞膜上形成临时孔洞。甘油有助于维护细胞膜的完整性，使细胞能够在电脉冲后自我修复。

关于电转用超级感受态细菌的详细制备方法、电转方法和电转效率检测方法，请观看我们的相关视频：

公众号：电转用超级感受态细胞制备（上）（中）（下）

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参考文献：

[1] Mandel M, Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J Mol Biol.1970;53:159–162

[2] Dower WJ, Miller JF, & Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res.1988;16:6127

[3] Kobayashi T, Akinori O, &Shibuya I. Membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli: alteration by glycerol and physiological consequences in a pss mutant. J Biochem.1986;99:1393–1400